Скільки існує методів стерилізації?

Методи стерилізації виробів медичного призначення — фізичний (паровий, повітряний) і хімічний (розчинами хімічних засобів, газовий, плазмовий). Кеш

Що таке метод стерилізації?

Стерилізація – це спеціальний метод, завдяки якій гинуть вегетативні і спорові форми патогенних і непатогенних мікроорганізмів, що знаходяться в стерилізується матеріалі. Кеш

Який спосіб стерилізації самий надійний?

Парова стерилізація або стерилізація вологим теплом являє собою процес, який використовує насичений пар під тиском, як стерилізуючий агент. Стерилізація парою є найбільш надійним процесом стерилізації і має пріоритетну значущість перед іншими методами. Кеш

Фізичні методи стерилізації - Microbiology Note

Методи стерилізації

Мета процесу стерилізації полягає в повному знищенні всіх живих мікроорга­нізмів і спор усередовищані або на поверхні об’єкту. Стерилізації піддаються поживні середовища, лабораторний посуд, інструменти, розчини і т. д.

Стерилізація (від латів. sterilis – безплідний, слово «стерилізація» в переказі означає знепліднення) – це знищення мікроорганізмів в різних об'єктах шляхом дії на них чинниками, згубними для мікробів.

Залежно від того, за допомогою яких факторів вбивають мікроорганізми, всі способи стерилізації розділяють на фізичні, механічні та хімічні; або на термічні та холодні.

Термічна стерилізація заснована на знищенні мікробів за допомогою високих температур. Знищення мікробів високими температурами легко здійснимо і ши­роко використовується в практичній діяльності людини та найчастіше застосовується в мікробіологічній практиці. При цьому потрібно пам'ятати, що у вегетативних (неспорових) клітин денатурація білків і загибель починається вже при температурі 56–60°С. Більш термостійкі спори гинуть в сухій атмосфері при температурі 160°С протягом 1–2 г., а у вологій середовищі загибель спор відбувається при температурі 112 –120°С протягом 20–30 хв.

Низькі негативні температури не вбивають, а лише затримують розвиток мікроорганізмів. Холодні способи стерилізації включають різноманітні прийоми знищення мікроорганізмів. Називають їх холодними умовно, щоб підкреслити, що вони не пов’язані з дією високих температур. До цих способів відносять хімічну стерилізацію або дезинфекцію, різні фізичні методи стерилізації (окрім викорис­тання температурного фактору) та механічне звільнення від мікроорганізмів.

До методів термічної стерилізації відносяться:

1) фламбірування, 2) кип'ятіння, 3) стерилізація сухим жаром, 4) стерилізація текучою парою, 5) стерилізація парою під тиском, 6) пастеризація, 7) дробна стерилізація та тиндалізація.

1. Фламбірування (від нім. flamme — полум'я) — прожарювання в полум'ї дрібних металевих або скляних предметів. Найбільш швидкий і доступний метод стерилізації. Проте його використання обмежується тільки термостійкими матеріалами. В такий спосіб стерилізують бактеріологічні петлі, металеві пінцети, скляні шпателі, палички, скельця, фарфорові ступки та інші інструменти. При прожарюванні згорають всі мікроорганізми (вегетативні та спорові форми). Це швидкий і надійний спосіб стерилізації. Після прожарювання охолоджені предмети не можна класти на стіл; їх слід тримати так, щоб вони не торкалися інших предметів.

2. Кип'ятіння є одним з найпростіших способів стерилізації. Проводиться в стерилізаторі (рис. 1) — металевій прямокутній коробці з кришкою і сіткою на дні для розташування предметів, що стерилізуються. Наливають в нього воду та нагрівають до кипіння. Кип'ятіння триває від 15–30 хв. до 2 г. при температурі біля 100°С.

Кип'ятінням стерилізують дрібні металеві або скляні предмети — шприци, голки, скляні трубки та ін. При цьому гинуть вегетативні форми мікроорганізмів і частина спор. Кип'ятінням у дистиляті стерилізують мембранні фільтри. Режим стерилізації для мембранних фільтрів 30 –60 хв. З моменту енергійного закипання води. У мікробіологічній практиці таким засобом стерилізації користуються рідко у зв'язку з тим, що тривале кип'ятіння може пошкодити оброблюваний матеріал, а скорочення часу кип'ятіння може не забезпечити стерильності.

3.Стерилізація сухим жаром. Проводиться гарячим повітрям в печі Пастера або сушильній шафі. Піч Пастера (рис. 2) є шафою з подвійними стінками, покритою зовні азбестом для теплоізоляції. Усередовищані шафи розташовані металеві полиці з отворами, на які поміщають матеріал, що стерилізується. Стерилізація проводиться при температурі 160 – 170°С протягом 1,5–2 г.

Стерилізують сухим жаром головним чином скляний посуд — чашки Петрі, піпетки, шпателі, пробірки, колби. Цей метод надійний — гинуть спорові і неспорові форми мікроорганізмів. Обернутий в папір простерилізований посуд можна зберігати.

4. Стерилізація текучою парою.

Проводиться гарячим вологим повітрям в апараті Коха (рис. 3).

Рис. 3. Апарат Коха. Водяна баня

У нижню частину металевого циліндру наливають воду, над нею розташовують полицю з отворами і матеріал, що стерилізується. Апарат щільно закривають коніч­ною кришкою з отвором посередовищані для виходу пари і нагрівають на вогні. Коли вода закипить, гаряча водяна пара з температурою біля 100°С «потече» сильним струменем з отвору кришки. З цієї миті відмічають час початка стерилізації. Стери­лізація текучою парою триває від 45 хв до 1,5 г залежно від об'єму матеріалу, що стерилізується. В такий спосіб стерилізують поживні середовища, які не можна нагрівати вище 100°С, наприклад м’ясо-пептонний желатин (при температурі вище 100°С він розріджується та не застигає). Цей спосіб стерилізації не достатньо надій­ний — повністю гинуть лише вегетативні форми мікроорганізмів, а спори зберіга­ються. Для досягнення повної стерилізації середовища в апараті Коха застосовують дробну стерилізацію.

5. Стерилізація парою під тиском. Проводиться насиченою водяною парою в автоклаві (рис.4). Автоклави бувають різної конструкції, але засновані на одному принципі. Це металевий двостінний казан, здатний витримувати високий тиск.

Рис. 4. Автоклав:1 — камера стерилізації; 2—кран для виходу повітря; 3 — манометр; 4 — за­побіжний клапан; 5 —парова камера; 6 — воронка для заповнення автоклава водою; 7 — отвори для надходження пари в камеру стерилізації; 8—кришка автоклава; 9 — підставка для розміщен­ня матеріалів, що стерилізуються.

Внутрішня частина казана — камера стерилізації, в яку поміщають матеріал, що стерилізується, оточена водопаровою камерою, яка має кран для виходу повітря і пари. При стерилізації у водопарову камеру наливають воду до необхідного рівня. Предмети у камері слід розміщувати не дуже щільно, оскільки пара повинна вільно минати між ними. Кришка автоклава герметично закривається.

Найпоширеніші режими стерилізації такі:

• 15–45 хв. при надлишковому тиску 0,5 атм (температура досягає 110 – 112 °С);
• 15–45 хв. при надлишковом тиску 1,0 атм (температура досягає 121 °С);
• 10–30 хв при надлишковому тиску 1,5 атм (температура досягає 126 °С).

Після закінчення часу стерилізації нагрів припиняють, відкривають паровий клапан і спускають пару. Стерилізують пором під тиском поживні середовища, скляний посуд, інструменти й ін. Автоклавування є швидким і надійним способом стерилізації, при якому гинуть всі форми мікроорганізмів, навіть найстійкіші спори. 6. Пастеризація. Цей прийом часткової стерилізації названий на честь фран­цузького вченого Л. Пастера. Спосіб полягає в тому, що рідину, налиту в сте­рильний посуд, прогрівають на водяній бані при температурі 60–90°С протягом 10–30 хв. Застосовуютьпастерізацію для середовищ, які змінють свої физико-хі­мічні властивості при високих температурах. У харчовій промисловості пастеризу­ють молоко, вершки, вино, пиво, соки й ін. При цьому повністю зберігаються ві­таміни і смакові якості продуктів. Пастеризовані продукти тривалому зберіганню не підлягають, оскільки при цьому способі стерилізації гинуть лише вегетативні форми мікроорганізмів, а спори залишаються. У лабораторній практиці в цей спосіб відділяють види мікроорганізмів, що утворюють спори від неспоротворних. У лабораторних умовах пастеризацію проводять або на водяній лазні, або в термостаті при наступних режимах: 60–70 °С 30 хв; 80 °С 10–15 хв.

1. Дробна стерилізація (тиндалізація або стерилізація текучою парою) використовується для стерилізації поживних середовищ і розчинів, які псуються при використанні температур вище 100 °С. Матеріал стерилізується, в декілька прийомів. Дробним може бути кип'ятіння або стерилізація текучою парою в апараті Коха. Метод розроблений Дж.Тиндалем. Матеріал стерилізують при 100 °С 10 хв. За цей час всі вегетативні клітини гинуть, життєздатними залишаються тільки спори. Потім рідину охолоджують до температури, оптимальної для проростання спор (30 °С), і через декілька годин знову пропускають пару. Двох-трьох подібних циклів зазвичай буває достатньо для знищення всіх спор. Тиндалізацію зазвичай проводять 3 дні по 30 хв щодня, а в перервах залишають матеріал при кімнатній температурі. Це робиться для провокації зростання спор у вегетативні форми і їх знищення при подальших обробках, що підвищує надійність цих способів.

Інший різновид дробної стерилізації (дробна пастеризація) проводиться у водяній бані при температурі 56–58°С протягом 1 г з 5–6-кратним повторенням через 24 г. В інтервалах між прогріваннями матеріал витримується при кімнатній температурі. Тиндалізацією стерилізують поживні середовища бідні мікроорганізмами, а також середовища, що містять речовини, які легко руйнуються і денатурують при температурі вище 60°С (білки, вітаміни). При холодній стерилізаціївикористовують хімічні речовини або діють на об'єкт чинниками фізичної природи. Хімічніметодиприпинення життєдіяльності мікроорганізмів основані на використанні дезинфектантов і антисептиків, що мають неспецифічний ефект, або використанні антибіотиків і синтетичних антимікробних препаратів з вибірковою протимікробною дією. Загибель мікроорганізмів при дезинфекції відбувається в основному в результаті гідролізу компонентів клітин, коагуляції білків, інактивації клітинних ферментів. Метод хімічної стерилізації застосовують при дезинфекції рук, робочого столу, відпрацьованих скелець і т. д. До антисептиків або дезинфікуючих засобів відносяться мило, деякі органічні барвники, солі важких металів, окисники (хлор, йод, перекис водню, перманганат калія), формалін, спирти (60–70 % водні розчини), кислоти, антибіотики, газоподібні речовини (формальдегід, окис етилену, озон) і ін. Стійкість мікроорганізмів до їх дії може суттєво змінюватися залежно від таких факторів, як концентрація активного компоненту, тривалість контакту, рН, температура, вологість. Фізичні методи стерилізації: стерилізація ультрафіолетовими променями, радіоактивним випромінюваннями, ультразвуком, струмом ультрависокої частоти і ін. Ці прийоми широко використовують в медицині. Стерилізація з використанням опромінення придатна для термолабільних матеріалів. Ультрафіолетові промені використовуються для стерилізації центрифужних пробірок, наконечників для піпеток, матеріалів з термолабільної пластмаси. Час опромінення визначається потужністю лампи, часом дії, ступенем і видовим складом мікроорганізмів забрудненого матеріалу. Вегетативні форми чутливіші до опромінення, чим спори, які в 3 – 10 разів більш стійкі. Від УФ-випромінювання мікроорганізми можуть бути захищені органічними речовинами, пилом або іншими захисними оболонками. Обмеженням при використанні даного методу стерилізації є низька проникаюча здатність УФ-променів і висока поглинаюча здатність води і скла. Рентгенівське і γ-опромінення також ефективно для стерилізації пластмас, харчових продуктів, але вимагає строгого дотримання правил безпеки. Найбільш чутливі до γ-опромінення вегетативні клітки бактерій, потім йдуть цвілеві гриби, дріжджі, бактерійні спори і віруси. γ-Опромінення використовується для стерилізації лікарняного приладдя, антибіотиків, вітамінів, гормонів, стероїдів, пластмасового разового устаткування, шовного і перев'язувального матеріалу. Для знезараження повітря використовують бактерицидні лампи. Зважаючи на можливу несприятливу дію ультрафіолетових променів на організм людини бактерицидні лампи включають лише за відсутності людей в приміщенні. Механічний метод стерилізації (стерилізація фільтруванням) застосовується в тих випадках, коли субстрати не витримують нагрівання і дії хімічних речовин (білки, сироватки, антибіотики, вітаміни, леткі речовини і ін.). Спосіб полягає в пропусканні рідин і газів через спеціальні дрібнопористі фільтри (бактерійні), діаметр пір яких не перевищує 0,45 – 0,2 мкм. Фільтри затримують мікроорганізми. Для пропускання розчину через фільтр потрібний вакуум або тиск. Існують два основні типи фільтрів – глибинні і мембранні. Глибинні складаються з волокнистих або гранульованих матеріалів, які спресовані, звиті або зв'язані в лабіринт проточних каналів. Частки затримуються в них в результаті адсорбції і механічного захоплення в матриксі фільтру. Мембранні фільтри мають безперервну структуру і захоплення ними часток визначається розміром пір. Фільтри містять різні природні (коалин, азбест, целюлоза) або синтетичні (похідні целюлози) матеріали. До таких дрібнопористих фільтрів, у яких розміри пір менше розмірів бактерій, відносяться фільтри Шамберлана (фільтрувальні свічки) з каоліну, пластинчасті азбестові фільтри Зейтца (рис. 5). Мембранні фільтри виготовляють з колодія, ацетату чи нітрату целюлози та ін. матеріалів. Фільтри закріплюються в спеціальному утримувачі (приборі Зейтца), який вставляється в приймач фільтрату — колбу Бунзена. Фільтр Зейтца автоклавують в зібраному вигляді. Перед стерилізацією фільтр із утримувачем, гумовою пробкою і колбою-приймачем загортають в папір. У відвідну трубку, яка буде приєднана до вакуумного насоса, вставляють ватний тампон. Рис. 5. Прилад для фільтрування із застосуванням свічки Шамберлана: 1- рідина, що фільтру­ється; 2- свічки Шамберлана; 3- гумова пробка; 4- колби Бунзена. Прилад Зейтца (а) і схема роботи мембранних (поверхневих) фільтрів (б); 1- великопориста скляна або металева пластинка; 2 і 3- верхня н нижня частини апарату Зейтца; 4- розрідження; 5- гумова пробка; 6- колби Бунзена; 7- мікробні клітки; 8- мембранний фільтр; 9-фильтрат. В мікробіологічній лабораторії та особливо на виробництві постійно здійснюють контроль ефективності стерилізації. Для цього визначають кількість клітин, які вижили після стерилізації, методом посіву в чашки (див. лабораторну работу № 6) за кількістю колоній, що утворюються. Використовують також і спеціальні біологічні індикатори (бактеріальні спори), які за визначених умов стерилізації гинуть з прогнозованою швидкістю. ► ХІД РОБОТИ ◄ 1. Посуд перед стерилізацією ретельно миють, висушують і загортають в папір (для збереження стерильності після прогрівання). 2. Кожну піпетку завертають окремо в довгі смужки паперу шириною 4 – 5 см. У широкі кінці піпеток, заздалегідь вставляють ватяні тампони. Обмотку починають з протилежного кінця поступовим рухом паперу по спіралі і закінчують біля кінця з тампоном. Папір повинен щільно охоплювати піпетку. Загорнуті піпетки для оберігання паперу від забруднення і розривів завертають по декілька штук разом або поміщають в спеціальні металеві або картонні пенали. 3. Чашки Петрі загортають разом по 2 – 4 штуки. Колби, пробірки закривають ватяними пробками, а зверху паперовими ковпачками. 4. Посуд, що підготовлений до стерилізації, завантажують в сушильну шафу не дуже щільно, щоб забезпечити циркуляцію повітря та рівномірне прогрівання предметів, що стерилізуються. Відмічають час, коли температура в шафі досягне 165–180°. Підтримують цю температуру протягом двох годин. Якщо шафа не забезпечена терморегулятором, необхідно весь час стежити за температурою, оскільки при пониженні її посуд не простерилизуется, а при нагріві вище 180° папір і пробки зачинають обвуглюватися. 5. По закінченні стерилізації вимикають нагріваючий пристрій. Шафу не відкривають до тих пір, поки температура в ній не впаде до 80°, тому що при різкому охолоджуванні може порушитися стерильність матеріалу і тріснути сильно нагріте скло. Простерилізований посуд зберігають в закритому, захищеному від пилу місці. Розгортають його безпосередньо перед використанням. ► КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ◄

1. Види стерилізації.
2. Автоклавування.
3. Стерилізація сухим жаром.
4. Стерилізація парою.
5. Пастеризація.
6. Дробна стерилізація.
7. Хімічна стерилізація.
8. Стерилізація фільтруванням.
9. Використання випромінювань для стерилізації.
10. Стерилізація посуду.

Лабораторна робота № 2. ВИВЧЕННЯ МОРФОЛОГІЇ МІКРООРГАНІЗМІВ.

1. МІКРОСКОПІЯ.

Вивчення невидимих неозброєним оком клітин мікроорганізмів, розміри яких не перевищують десятків і сотень мікрометрів, можливо тільки за допомогою мікро­скопів. Ці прилади дозволяють отримувати в сотні раз (світлові мікроскопи) і в десятки — сотні тисяч разів (електронні мікроскопи) збільшене зображення досліджуваних об'єктів. За допомогою мікроскопа вивчають морфологію клітин мікроорганізмів, їх зростання і розвиток, проводять первинну ідентифікацію дослід­жуваних організмів, ведуть спостереження за характером розвитку мікробних цено­зів (співтовариств) в різних субстратах. Мікроскоп складається з двох частин: механічної (підсобної) і оптичної (голов­ної|). До механічної частини мікроскопа відносять штатив, предметний столик і тубус. Штатив має основу і тубусотримач у формі дуги. До нього примикає система для регуляції положення тубуса, яка приводиться в рух обертанням макрометричного і мікрометричного гвинтів. Макрометричний гвинт (макрогвинт) служить для попередньої орієнтовної уста­новки зображення даного об'єкту. Мікрометричний гвинт (мікрогвинт) використовують для подальшої чіткої установки на фокус. При повному повороті мікрогвинта труба пересувається на 0,1 мм. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою труба опускається у напрямку до препарату, при обертанні проти годинникової стрілки — піднімається від препарату. Предметний столик служить для розміщення препарату з об'єктом дослідження. Предметний столик переміщається за допомогою гвинтів в двох взаємоперпендику­лярних напрямах. В центрі столика знаходиться круглий отвір для освітлення препарату знизу. До столику вмонтовано два затиски (клеми) — пружинячі металеві пластинки, призначені для закріплення препарату. 1 — окуляр; 2 — бінокулярна насадка; 3 — гвинт кріплення насадки; 4 — револьверний пристрій; 5 — об'єктиви; 6 — гвинтовий упор (обмежувач переміщення предметного столика при фокусуванні); 7 — предметний столик; 8 — рукоятка переміщення предметного столика в двох взаємноперпендикулярних напрямах; 9 — рукоятка грубого фокусування; 10 — рукоятка точного фокусування; 11 — колектор в оправі; 12 — основа мікроскопа; 13 — конденсор; 14 — гвинт кріплення конденсора; 15 — препаратоводій Рис. 6. Мікроскоп МІКМЕД-5 Тубус (труба) — оправа, в яку поміщені елементи оптичної системи мікроскопа. До нижньої частини тубуса прикріпляється револьвер (об’єктивотримач) з гніздами для об'єктивів. Оптична частина мікроскопа складається з основного оптичного вузла (об'єктив і окуляр) і допоміжної освітлювальної системи. Всі частини оптичної системи строго центровані відносно один одного. Освітлювальна система знаходиться під предметним столиком. Конденсор (від лат. condenso —згущую), що складається з 2–3 короткофокусних лінз, збирає промені, що йдуть від освітлювального пристрою, і направляє їх на об'єкт. Конденсор необхідний перш за все при роботі з імерсійною системою. Лінзи конденсора вмонтовані в металеву оправу, сполучену із зубчастим механіз­мом, що дозволяє переміщати конденсор вгору і вниз спеціальним гвинтом. Для регулювання інтенсивності освітлення в конденсорі є ірисова (пелюсткова) діафрагма, що складається із сталевих серповидних пластинок. Забарвлені препарати краще розглядувати при майже повністю відкритій діафрагмі, незабарвлені — при зменшеному отворі діафрагми. Об'єктив — найбільш важлива частка мікроскопа. Це багатолінзова короткофо­кус­на система, від якості якої залежить в основному зображення об'єкту. Зовнішня лінза, повернута плоскою стороною до препарату, називається фронтальною. Саме вона забезпечує збільшення. Решта лінз в системі об'єктиву виконує переважно функції корекції оптичних недоліків, що виникають при дослідженні об'єктів. Об'єктиви бувають сухі та імерсійні. При роботі з сухими об'єктивами між фронтальною лінзою об'єктиву і об'єктом дослідження знаходиться повітря. Оптичний розрахунок імерсійних об'єктивів передбачає їх роботу при зануренні фронтальної лінзи об'єктиву в рідку однорідну середовище. При роботі з сухим об'єктивом унаслідок різниці між показниками заломлення скла (1,52) і повітря (1,0) частка світлових променів відхиляється і не потрапляє в око спостерігача. При роботі з імерсійним об'єктивом необхідно помістити між покривним скельцем і лінзами об'єктиву імерсійне масло. Показник заломлення цього масла близький до показника заломлення скла. Промені в оптично однорідному гомогенному середовищі не змінюють свого напряму. Об'єктиви розрізняють по їх збільшенню. Величина збільшення об'єктивів по­зна­чена на їх оправі (4x 10х, 40x, 100х). Кожен об'єктив характеризується, крім того, визначеною величиною робочої відстані в міліметрах. Для об'єктивів з малим збільшенням відстань від фронтальної лінзи об'єктиву до препарату більша, ніж для об'єктивів з великим збільшенням. Одна з важливих характеристик об'єктиву — роздільна здатність. Вона визначає найменшу відстань між двома точками на препараті, при якому їх зображення буде роздільним. Окуляр служить безпосереднім продовженням «лінз» (кришталиків) очей люди­ни. Окуляр складається з двох лінз – очної (верхньої) і польової, або збірної (нижньої) – в металевій оправі. Призначення польової лінзи — збирати промені, що йдуть від об'єктиву, так, щоб вони проходили через маленький отвір очної лінзи. Призначення окуляра — пряме уявне збільшення дійсного зворотного і збільшеного зображення, яке дає об'єктив. Збільшення окуляра вигравійоване на його оправі. Робоче збільшення окуляра коливається в межах від 4х до 15х. Основні технічні характеристики мікроскопа Коефіцієнт збільшення мікроскопа визначається добутком збільшення окуляра і збільшення об'єктиву. Теоретично мікроскоп може дати збільшення ~2000 раз і більш. Проте слід розрізняти корисне і некорисне збільшення мікроскопа. Межі корисного збільшення в зазвичай використовуваних мікроскопах. досягають ~1400. При перевищенні меж корисного збільшення виникає дифракція і інші явища, обумовлені хвилевою природою світла. Роздільна здатність мікроскопа особливо важлива при дослідженні мікрооб'єктів і їх структур. Якщо збільшувальна здатність мікроскопа залежить від об'єктиву і окуляра, то роздільна здатність визначається головним чином об'єктивом і конденсором. Максимальна роздільна здатність світлового мікроскопа складає 0,2 мкм. Основні правила роботи з мікроскопом.

• Місце для мікроскопа вибирають подалі від прямого сонячного світла. Робота на столі з темною поверхнею менше стомлює очі.
• Краще дивитися в окуляр лівим оком, не закриваючи правого. В разі роботи з бінокулярною насадкою спочатку регулюють відстань між окуляром відповідно до відстані між очима спостерігача так, щоб поля зору обох окуляра злилися в одне.
• Переносити мікроскоп необхідно двома руками: однією тримати штатив, іншою — основу мікроскопа. Слід оберігати мікроскоп від поштовхів, зіткнення з сильнодіючими речовинами (кислотами, лугами і т. п.).
• Не рекомендується виймати окуляр з труби, щоб не забруднювати пилом трубу і об'єктиви.
• Лінзи мають бути завжди чистими. Не можна торкатися пальцями оптичних поверхонь.
• Мікроскоп слід зберігати в чохлі.